 mRNA 一级序列由多种元件构成，包括目的蛋白编码区（CDS）、位于两侧的非翻译区（UTR）、PolyA 尾巴。对于 CDS 序列来说，使用目标生物体或者组织中高表达的密码子，可增强翻译水平，而替换掉 CDS 序列中的尿嘧啶，可避免 mRNA 被内体中的 toll 样受体检测到,从而逃避先天免疫反应。核糖体与 5' UTR 结合并扫描蛋氨酸起始密码子。3' UTR 还包含蛋白质和 microRNA 的结合位点,对细胞特异性表达和稳定性至关重要。mRNA 还可折叠成与蛋白质相互作用的二级结构,从而进一步延长 mRNA 的半衰期,但也可以与激活先天免疫反应的 dsRNA 受体结合。mRNA 以 poly(A) 尾结束,该尾回环以增强翻译起始,并保护 mRNA 被 3' 外切酶降解。mRNA 序列设计是 mRNA 疫苗或者药物开发的关键第一步。优化 mRNA 序列，可增强其翻译和蛋白表达，提升 mRNA 稳定性，降低 mRNA 免疫原性。因此，根据不同的应用场景，优化 mRNA 序列，才能更好地发挥 mRNA 的治疗潜力。近日，澳洲昆士兰大学生物工程和纳米技术研究所和 Base Facility 的 Helen M. Gunter 团队在 bioRxiv 上传预印本文章：mRNArchitect: optimized design of mRNA sequences，他们开发了一款开源软件工具包，称为 mRNArchitect，可根据用户需求，基于 GC 含量、二级结构、密码子及尿嘧啶耗竭等标准 ，快速组装优化 mRNA 序列。mRNArchitect 现可免费使用，网址如下所示： https://basefacility.org.au/software/ https://github.com/BaseUQ/mRNArchitect  mRNArchitect 软件使用mRNArchitect 软件的使用非常简单，共有 3 部分组成：输入序列、参数设定及输出序列。研究人员使用 mRNArchitect 优化了一个编码荧光素酶蛋白的 mRNA 序列，可分为以下步骤：输入序列
 参数设定mRNArchitect 可以根据一系列参数优化 mRNA 序列。mRNArchitect 创建在 DNA Chisel 框架之上，该框架根据一组标准确定最佳序列，包括 GC 含量、密码子翻译速度和 mRNA 二级结构（例如发夹结构）。
 输出序列mRNArchitect 输出序列提供完全组装和优化的且易于合成的 mRNA 候选序列。此外，这些后续序列还提供特征描述参数，例如，密码子适应指数 CAI 和最低吉布斯自由能 MFE。  分析优化结果与原始 P . pyralis 的荧光素酶 mRNA 序列相比，mRNArchitect 优化后的 mRNA 序列相似性为 74%，尿苷含量降低 (从 26%降至 16%) ,GC 含量增加 (从 45%增至 56%) ,MFE 减少 (从-466.4 降至-534.2) ,CAI 增加 (从 0.68 增至 0.859) 。将 mRNArchitect 优化后的 mRNA 序列与 LinearDesign 或者 mRNAid 优化后的 mRNA 做比较，并且以一个具有低 CAI 值的稀有密码子 mRNA 序列作为对照组。mRNArchitect-Luciferase mRNA 与 mRNAid-mRNA 序列相似性最高(89%),其次是 LinearDesign(78%)和罕见密码子组(66%）。 mRNArchitect mRNA 拥有中等的 CAI （0.859） 和相对较高的 MFE （-534.2），mRNAid mRNA 拥有较高的 CAI （0.965） 和较低的 MFE （-593.0），而 LinearDesign mRNA 拥有较低的 CAI （0.734） 和最低的 MFE （-1111.5）。对照组稀有密码子 mRNA 拥有最低的 CAI 最低（0.62） 和最高 MFE （-351.9）。将这些不同程序优化的 Luc mRNA 转染 HEK293-T 细胞，转染 4 小时后，每个 mRNA 的 CAI 值与其对应的 Luciferase 蛋白表达之间存在线性关系。  不同优化参数对于 mRNA 序列的影响。当使用相同的序列优化参数时，编码相同氨基酸序列的不同输入序列对输出 mRNA 序列的 CAI 或 MFE 影响极小。相反，改变序列优化参数，对于输出 mRNA 序列的影响极大。尽管总尿苷含量仅略有增加（~4%），但未选择耗竭尿苷参数（UD ）优化后的 Luc mRNA 比选择 UD 优化后的 mRNA 序列具有更高的 CAI 和更低的 MFE。将最大 GC 含量增加到 70% 或 80% 会进一步增加 CAI 并降低 MFE 值，但最大 GC 含量为 90% 或 100% 的设计并没有显示出对 CAI 或 MFE 值的进一步改善。此外，对于 GC 含量高（>60%）的 mRNA 来说，其 DNA 模板合成存在困难。最后，放宽所有 Reapts 和 GC 含量参数的限制，输出 mRNA 序列的 CAI 变为 1。  小结随着确定调节翻译速率、亚细胞定位和稳定性的序列特征，mRNA 序列设计领域正在取得飞速发展。mRNA 序列设计的持续改进，以及对细胞内 mRNA 生物学的理解增加，将进一步增强 mRNA 疗法。同时，研究者将继续通过集成新元素和新功能来改进 mRNArchitect，为科学家设计创新型 mRNA 药物提供坚实的支撑。BioFactory留胡子的豆腐 出品本公众号所发文章仅用于业内学术分享，文章图片引自文献本身，欢迎转载，共学习。 请相信： 21世纪是生物的世纪， 然而，这和你并没有太大的关系... 纸上谈兵，偏见解读，偶尔瞎扯，欢迎指正。  |
